Анотация

За последнее десятилетие исследование с целью улучшения показателей эффективности в области репродуктивной медицины было сфокусировано в основном на понимании и оптимизации качества эмбриона. Тем не менее, появление персонализированной медицины в стимуляции овуляции и эмбриологии сместило фокус оценки индивидуального состояния эндометрия. Эндометрий считается готовым для имлантации в течении индивидуально определенного периода времени, имплантационного окна (ИО), когда организм матери позволяет бластоцисте присоединиться к имплантату. Этот индивидуальный статус восприимчивости теперь можно объективно диагностировать при помощи теста состояния имплантационной готовности (ERA), разработанного в 2011 году. ERA, вместе с вычислительным алгоритмом обнаруживает уникальную транскриптомную сигнатуру состояния имплантационной готовности эндометрия путем анализа 238 дифференцированно экспрессированных генов и достоверного прогнозирования ИО. Мы и другие продемонстрировали полезность этого персонализированного диагностического подхода, направленного на различение индивидуального физиологического изменения восприимчивости эндометрия и неизвестной патологии эндометрия, которая считается причиной рецидивирующей имплантационной недостаточности (РИН). Международное рандомизированное контролируемое исследование («Тест ERA в качестве диагностического руководства для персонализированного переноса эмбриона.» Идентификатор ClinicalTrials.gov: NCT01954758) находится в стадии реализации для определения клинической ценности этого диагностического вмешательства эндометрия в исследовании в области охраны репродуктивного здоровья. В этом обзоре мы анализируем текущую клиническую практику в диагностике эндометриального фактора вместе с новыми возможностями исследований.

Введение

Успешная имплантация эмбриона в эндометрий матери является результатом идеальной синхронности между жизнеспособной бластоцистой, готовностью эндометрия к имплантации и соответствующей коммуникацией между ними [1]. Наиболее изученным элементом имплантационной триады является эмбрион, который стремится прорости в эпителий эндометрия и вторгнуться в децидуализированную строму, инициируя инвазию трофобласта и формирование плацентации. Действительно, понимание предимплантационного развития человека имеет решающее значение (для обзора см. [2]), так же как растворимые лиганды, полученные и получаемые их рецепторами, предназначенными для опосредования данного фундаментального процесса (для обзора см. [3]). Тем не менее, исследованием с целью развития понимания эндометриального компонента имплантации в значительной степени пренебрегали.
Материнский эндометрий готов к имплантации эмбриона только в течение определенного периода времени в менструальном цикле, известного как имплантационное окно (ИО). Классически считается, что данный период происходит через 8-10 дней после овуляции и длится 2 или 3 дня, в течение которых приобретается функциональный и транзиторный овариальный стероид-зависимый статус для возможности бластоцисты имплантироваться. Это классическое определение было установлено на основании соответствующего клинического исследования [4], но без фундаментальных исследований, поддерживающих его. В этом важном вкладе, опубликованном Вилкоксом с соавт. в 1999 году [4], день овуляции был определен на основе изменений в мочевой экскреции метаболита эстрадиола эстрон-3-глюкуронида и метаболита прогестерона прегнандиол-3-глюкуронида, уровень которых измеряли при помощи радиоиммуноанализа. Авторы разработали алгоритм для идентификации дня овуляции, основываясь на соотношении этих мочевых метаболитов гормонов, и утверждали, что тест был аналогичным измерению пика лютеинизирующего гормона (ЛГ) [4]. Тем не менее, 26 лет спустя, метод, предложенный этими авторами для идентификации овуляции не был клинически принят. Кроме того, теперь мы признаем ограничения использования измерения уровня ЛГ в моче или даже в крови, чтобы спрогнозровать овуляцию [5]. Тем не менее, клиническое сообщество, с тех пор предполагает, что у всех пациенток эндометрий становится восприимчивым в течение указанного периода времени (от 8 до 10 дней после овуляции), вне зависимости от индивидуальных характеристик или получаемой гормональной терапии (то есть, естественных циклов или контролируемой стимуляции яичников).

Восприимчивость эндометрия у человека

На сегодняшний день не было выявлено ни одного молекулярного или гистологического биомаркера для объективной и надежной диагностики восприимчивости эндометрия. При отсутствии такой диагностики, эндометрий поддерживали прогестероном или хорионическим гонадотропином человека (ХГЧ) в качестве единственного «эндометриального лечения» у пациентов, прибегших к вспомогательным репродуктивным технологиям (ВРТ). Соответственно, при переносе эмбрионов (ПЭ) руководствовались только качеством и стадией развития эмбриона, а также толщиной слоя эндометрия. Тем не менее, мы продемонстрировали, что в 25% случаев повторная несостоявшаяся имплантация обусловлена эндометриальным происхождения [6], что согласуется с клинической значимостью восприимчивости эндометрия в успешной беременности [7]. 
В 1950 году Нойес с соавт. при помощи гистологического исследования определили критерии дат для оценки эндометрия [8]. Тем не менее, несколько рандомизированных [9,10] и перспективных исследований [11-17] поставили под сомнение точность и воспроизводимость метода Нойеса для диагностики восприимчивости эндометрия или статуса фертильности.
Последующее исследование было направлено на обнаружение биохимических маркеров для оценки состояния эндометрия. Хотя в эндометрии было выявлено множество молекулярных медиаторов, включая факторы роста, цитокины, хемокины, липиды и молекулы адгезии [1,7], до сих пор ни одна из этих молекул не была установлена в качестве биомаркера эндометрия в клинической практике [18]. 
Развитие методов молекулярной биологии, наряду с глобальными транскриптомными анализами, позволили провести исследование геномики развития эндометрия человека [19]. Транскриптомные анализы идентифицируют активно экспрессируемые гены на уровне мРНК в любой заданный момент времени [20]. Эндометриальные транскриптомные анализы у человека показывают, что существуют дифференциальные паттерны экспрессии генов на различных этапах менструального цикла [21, 22], в том числе во время восприимчивой фазы [19, 23]. Кроме того, дифференциальные транскриптомные профили были обнаружены у пациенток с повторяющимися неудачи имплантации [24-26], а также патологиями эндометрия, такими как эндометриоз или рак эндометрия [27, 28], а также паттерны экспрессии генов были определены во время проведения циклов контролируемой стимуляции яичников (КСЯ) и гормональной заместительной терапии (ГЗТ) [29, 30]. Эти усилия позволили открыть уникальную геномную сигнатуру восприимчивости эндометрия, которая стала основой теста состояния имплантационной готовности (ERA) [31]. Этот анализ диагностирует молекулярное состояние восприимчивого эндометрий в соответствии с его транскриптомной сигнатурой, независимо от его гистологического проявления [31].

Тест состояния имплантационной готовности

ERA представляет собой новый метод диагностики, клинически доступный во всем мире, который классифицирует эндометрий в качестве восприимчивого, предварительно восприимчивого, или пост-восприимчивого [6]. Тест требует биопсии небольшого участка ткани эндометрия, взятой в ходе планового лечения либо через 7 дней после пика лютеинизирующего гормона (ЛГ + 7) в естественном цикле, либо через 5 дней после введения прогестерона после введения усиленной дозы эстрогена в цикле гормональной заместительной терапии (Р + 5). РНК, экстрагированную из ткани, наносят на микропанель для определения транскриптомного профиля 238 генов. Этот транскриптомный профиль, в сочетании с вычислительным прогностическим фактором, объективно определяет, является эндометрий восприимчивым, предварительно восприимчивым или пост-восприимчивым при помощи кластерного анализа относительно обучающей выборки [6, 31]. 238 генов, проанализированных при помощи ERA были выбраны в соответствии с данными экспрессии 14 предыдущих работ нашей группы, проводящей поиск транскриптомной сигнатуры восприимчивости эндометрия в естественных циклах, КСЯ, ГЗТ и даже у пациенток с внутриматочным контрацептивом (ВМК) (для обзора см. [19]). Хотя эти гены были отобраны при помощи t-теста с абсолютным кратным изменением > 3 и уровнем ложноположительных результатов <0,05, было проведено клиническое подтверждение с обучающей выборкой у реальных пациенток [31]. Важно отметить, что результат, полученный при помощи ERA, не зависит от гистологического появления эндометрия и продемонстрировал большую точность, чем гистологическое датирование [32] и является полностью воспроизводимым даже с интервалом до 40 месяцев между образцами [32]. Этот результат согласуется с идеей о том, что статус восприимчивости остается тем же самым у каждой женщины на протяжении всей своей жизни, но что различные гормональные терапии и состояний, такие как беременность могут изменить эндометрий, поскольку это орган является гормонально регулируемым.
Анализ более 6000 результатов теста ERA, проведенных нашей группой, указывает на то, что примерно у 30% пациенток биопсия эндометрия классифицирует его как невосприимчивый. В этих случаях прогностический фактор описывает, является ткань предварительно восприимчивой (85,0%) или поствосприимчивой (12,6 %). Основываясь на этих результатах, алгоритм затем рекомендует сроки прогестеронотерапии для каждой конкретной пациентки с целью нахождения ее персонализированного ИО, получая тем самым оптимальный шанс успешной имплантации посредством персонализированного переноса эмбриона (пПЭ)( Рис. 1).

Персонализированный перенос эмбриона

Клиническое применение ERA изучали в ходе проспективного, интервенционного многоцентрового клинического исследования у 85 пациенток с рецидивирующей имплантационной недостаточностью (РИН) по сравнению с 25 пациентками контрольной группы, проходящими ЭКО впервые [6]. Биопсия эндометрия была классифицирована как восприимчивой у 74,1% пациенток с РИН; когда перенос эмбрионов проводили в соответствии со сроками, указанными при проведении диагностики ERA, у пациенток была достигнута частота имплантации 33,9% и частота наступления беременности 51,7%. Тем не менее, наблюдалось смещение ИО у одной из четырех пациенток с РИН, которое диагностировали при помощи ERA [6]. У этих 26,3% пациенток, когда перенос эмбрионов выполняли в соответствии со сроками ИО, диагностированными при помощи ERA, частоты наступления беременности и имплантации возросли до уровня нормально восприимчивых пациенток из группы контроля, в ходе данного первоначального исследования 7 пациенток прошли процедуру пПЭ. 
Сообщалось о клиническом случае успешного персонализированного переноса эмбриона у пациентки, прошедшей четыре ЭКО и три имплантации донорских яйцеклеток с негативным исходом [34]. У этой пациентки было диагностировано смещение ИО при помощи ERA. Таким образом, персональный перенос эмбрионов из двух бластоцист проводили через 7 дней после введения прогестерона (Р+7) в цикле ГЗТ, что привело к успешной двуплодной беременности после 7 предыдущих повторных неудач имплантации. Аналогично, в экспериментальном исследовании 17 пациенток, перенесших имплантацию донорских яйцеклеток, у которых были неудачные имплантации при проведении рутинного переноса эмбрионов, частота имплантации была увеличена с 12,9 до 34,5 %, а частота наступления беременности с 23,5 до 52,9%, когда пПЭ проводили после диагностики при помощи ERA [33]. У всех 17 пациенток была первоначально диагностировано смещение ИО, при чем биопсия эндометрия была классифицирована как предварительно восприимчивой у 16 пациенток и пост-восприимчивой у одной пациентки [33].
Значение диагностики восприимчивости эндометрия во время рутинного исследования бесплодия у пациенток, прибегших к вспомогательным репродуктивным технологиям в настоящее время изучается в ходе международного, многоцентрового, проспективного, рандомизированного, интервенционного и контролируемого исследования - «Тест ERA в качестве диагностического руководства для персонализированного переноса эмбриона», в ходе которого сравнивают свежий перенос эмбрионов по сравнению с элективным отсроченным переносом эмбриона или пПЭ (Идентификатор trails.gov, ClinicalTrials.gov: NCT01954758).

МикроРНК: Новые молекулы, продвигающие наши знания в области репродуктологии

Несмотря на обилие информации, полученной за последние годы, технологии продолжают развиваться, чтобы получить возможность обнаружить все транскрипты по всему транскриптому. В 2014 году Ху с соавт.. сообщил о первом глобальном профиле экспрессии генов в эндометрии человека с использованием определения последовательности РНК следующего поколения, с высокой пропускной способностью (определение последовательности )РНК) [34]. Это  транскриптомное сравнениена основе последовательностей РНК предварительно восприимчивого и восприимчивого эндометрия человека выявило в общей сложности 2372 дифференцированно экспрессируемых генов, включая членов семейства металлотионеинов, bers, HAP1, ZCCHC12, MRAP2, OVGP1, регуляторные факторы (GLI2, CDC25A, TLR9, MT1G и SLC5A1), а также факторы транскрипции (AP2 и SP1), которые ранее не были связаны с восприимчивостью эндометрия. Кроме того, открытие микроРНК в качестве потенциальных посттранскрипционных регуляторов экспрессии генов [35] представляет собой прорыв в биологии за последние десять лет и стало чрезвычайно активной областью исследований [36-39]. 
МикроРНК представляют собой маленькие, некодирующие последовательности РНК от 18 до 25 нуклеотидов, которые посттранскрипционно регулируют экспрессию генов [40]. Эти молекулы не кодируют белки; вместо этого кодируют микроРНК-мишени мРНК посредством спаривания комплементарной основы к 3'нетранслируемым областям для деградации или репрессии, таким образом, функционируют в качестве генных глушителей [41]. На основании степени гомологии последовательностей, одна микроРНК может потенциально нацеливаться на широкий спектр генов и один ген может регулироваться несколькими микроРНК [40]. Первоначально длинные предшественники (при-микроРНК) транскрибируются и обрабатываются в более короткие предшественники (пре-микроРНК) в ядре [37]. Эти предшественники экспортируются в цитоплазму и включаются в РНК-индуцируемый комплекс выключения гена (RISC) для связывания с мРНК-мишенью [42], как показано на  Рис. 2.

Как было установлено для мРНК, микроРНК дифференциально экспрессируются в эндометрии в течение всего менструального цикла [43]. Затем, эпителий эндометрия высвобождает микроРНК, которые выделяются в эндометриальную жидкость [43]. Профилирование транскриптов микроРНК и мРНК в эндометрии человека свидетельствует о том, что гормональная регуляция микроРНК приводит к подавлению пролиферации клеток путем     регуляция экспрессии в сторону уменьшения некоторых генов клеточного цикла в эпителии эндометрия во время секреторной фазы [44]. Выделяя эндометриальные эпителиальные клетки из биопсии эндометрия 14 женщин детородного возраста в конце пролиферативной фазы и в средине секреторной фазы, Куокканен с соавт. определили микроРНК-29B, микроРНК-29C, микроРНК-30B, микроРНК-30D, микроРНК-31, микроРНК-193A-3P, микроРНК-203, микроРНК-204, микроРНК-200C, микроРНК-210, микроРНК-582-5P, и микроРНК-345, как таковые со значительный увеличением в секреции эндометрия. В самом деле, подмножество микроРНК, а именно hsa-miR-30b и hsa-miR-30d значительно регулируются в сторону повышения, в то время как hsa-miR-494 и hsa-miR-регулируются в сторону уменьшения в восприимчивом эндометрии (ЛГ + 7) по сравнению с предварительно восприимчивым эндометрием (ЛГ + 2) у женщин детородного возраста [45]. Эти данные подтверждают ранее сообщенные данные о регуляции в сторону повышения hsa-miR-30b и hsa-miR-30-dпри приобретении восприимчивости эндометрия [46]. Участие микроРНК в неудачной имплантации эмбрионов было предположено у пациентов с рецидивирующей имплантационной недостаточностью [47]. Существование 13 дифференциально экспрессированных микроРНК (микроРНК-145, микроРНК-23b, микроРНК-99а, микроРНК-27b, микроРНК-652, микроРНК-139-5p, микроРНК-195, микроРНК-342-3p, микроРНК-150, микроРНК-374b, микроРНК-32, микроРНК628-5b, микроРНК-874) было описан у пациенток с рецидивирующей имплантационной недостаточностью; они могут регулировать экспрессию до 3800 генов [47].

В последнее время наша группа продемонстрировала, что hsa-miR‑30d секретируется в эпителии эндометрия человека в эндометриальную жидкость либо свободно, либо в форме, ассоциированной с экзосомой и могут быть включены в предимплантационную стадию эмбриона, чтоюы потенциально изменить его транскриптом [43]. Интернализация этих результатов по микроРНК в непрямую избыточную экспрессию генов, кодирующих определенные молекулы, участвующие в эмбриональной адгезии, таких как ITGB3, ITGA7 и CDH5 [43]. Кроме того, было высказано предположение, что микроРНК могут выделяться эмбрионом человека [48]; hsa-miR‑191, hsa-mi-372, иhsamiR‑645 дифференциально экспрессируются в соответствии с методом оплодотворения, хромосомным статусом и исходом беременности. В совокупности эти данные подтверждают концепцию материнско-эмбрионального перекрестного диалога, который использует множество различных языков, а именно микроРНК в качестве одного из них.

Вывод

Статус восприимчивостью эндометрия теперь можно надежно диагностировать при помощи теста ERA, объективного молекулярного инструмента на основе транскриптомных сигнатур восприимчивсти эндометрия человека, чтобы идентифицировать ИО. ERA может направлять и улучшить нашу клиническую практику путем внедрения и предоставления персонализированной диагностики ИО и, соответственно, персонифицированного переноса эмбрионов. В ближайшее время проблема будет заключаться в определении биомаркеров восприимчивости эндометрия, которые могут быть оценены при помощи неинвазивных методов. МикроРНК могут быть интересными молекулами-кандидатами, в частности, с потенциальной ролью микроРНК материнского эндометрия как транскриптомных модификаторов предимплантационного эмбриона.